Ocupa um espaço privilegiado no centro de Évora, cidade Património Mundial, tendo na sua génese a coleção de Frei Manuel do Cenáculo (1724-1814), influente intelectual do período pombalino, colecionador de arte e um dos pioneiros da arqueologia em Portugal. 

Foi promovido a Museu Nacional em 2017, gesto que afirma o valor da sua coleção, albergando alguns dos nossos “tesouros nacionais”, como o Tríptico da Paixão de Cristo, pintado em esmalte por Nardon Pénicaud no século XVI, e o imponente Retábulo Flamengo (c. 1500), o maior e um dos mais importantes conjuntos de pintura flamenga existentes em Portugal. 

Do acervo de vinte mil peças, destaca-se uma coleção que permite reconstituir a história da pintura antiga portuguesa, desde A Virgem com o Menino (c. 1410), de Álvaro Pires de Évora, o Tríptico do Bom Jesus de Valverde (1544), de Gregório Lopes, ou São Jerónimo, Santo António e São Dinis, de Diogo de Contreiras (século XVI), a obras de importantes pintores luso-flamengos como Francisco Henriques e Frei Carlos. Na coleção de escultura, destacam-se os elementos de arquitetura provenientes de monumentos da cidade e importantes exemplares de tumulária dos séculos XIV ao XVIII, com relevo para as obras atribuídas a Nicolau de Chanterene (primeira metade do século XVI) ou o túmulo de Fernão Gonçalves Cogominho (c. 1364).

As coleções apresentam importantes núcleos de ourivesaria, numismática, naturalia (objetos exóticos do mundo natural) e arqueologia, estas três últimas constituídas essencialmente por peças reunidas pelo arcebispo Frei Manuel do Cenáculo. Refira-se ainda a coleção Leonor Pina, com o fantástico espólio da Anta Grande do Zambujeiro, e a chamada coleção do Hospital, com achados referentes a outras antas do concelho de Évora, Herdade das Casas, Castelo da Lousa e Castelo do Geraldo.

Tem como anexo, desde 1917, a Igreja de Nossa Senhora das Mercês, edifício do século XVII que já correspondeu à secção de Artes Decorativas do Museu, encontrando-se encerrada por razões de conservação.